项目文章|单细胞测序揭示排卵前卵泡微环境的内在异质性
近日，南京医科大学附属苏州市立医院生殖与遗传学中心李红教授团队采用新格元单细胞测序技术在《Biomolecules》上发表卵泡微环境异质性的单细胞转录组测序文章，题为：Single-Cell Sequencing Reveals an Intrinsic Heterogeneity of the Preovulatory Follicular Microenvironment。文章采用6例人的卵泡液以及卵丘细胞，利用新格元自主研发的GEXSCOPE®海量单细胞测序技术，成功获得了高质量的单细胞测序数据，为理解卵母细胞成熟和排卵过程的调控提供了有价值的见解，为卵母细胞发育相关疾病和排卵相关疾病的诊断和治疗提供了潜在线索。
研究背景
卵巢是一个重要的生殖器官，是卵母细胞的来源，也是女性类固醇性激素的主要供应者。卵巢的一个主要功能成分是卵泡。卵泡微环境，包括卵泡内颗粒细胞(GC)，负责卵母细胞成熟和随后的排卵。然而，排卵前卵泡中GCs的功能和卵泡微环境的细胞成分还没有得到广泛的研究，对排卵前卵泡的微环境进行详细而全面的研究将为理解排卵过程提供新的视角。
方法流程
为了研究卵泡微环境的异质性细胞群体及其在排卵前卵泡中的特殊功能，对6名接受体外受精的患者注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)后，收集了六个包含卵泡和卵丘细胞样本，进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)，并对所有数据进一步分析。
主要结果
1.人排卵前卵泡中的单细胞聚类和细胞类型鉴定
作者鉴定出六种主要细胞类型:颗粒细胞(GCs)，巨噬细胞，树突状细胞(DCs)，中性粒细胞，T细胞和上皮细胞(图1D-E)。
图1 卵泡液中的细胞和卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞(CCS)构成了卵泡微环境
2.不同GC亚群在排卵中发挥不同功能
作者鉴定了9个不同的颗粒细胞群体，包括G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8和G9簇(图2A)。使用HCG后，排卵前卵泡中的几个簇(G1，G2和G3)都富含与胆固醇和类固醇合成和代谢有关的基因，它们是P合成的重要参与者。G5和G6显示出高水平的GJA1，FN1和CDH2，参与细胞-细胞连接(图2B)。G5高度表达的ADAMTS1是一种分泌的广泛细胞外基质(ECM)蛋白酶，在卵巢组织的ECM重塑中起重要作用，是排卵的关键过程。G4可能通过PTGS2/IL-1B和MERTK参与排卵的炎症反应和凋亡底物的去除。G7中差异表达最高的基因表明其在调节细胞迁移和与免疫系统相互作用粘附中发挥重要功能。G8高度表达与蛋白泛素化相关的标记物。G9的特征在于与有丝分裂细胞周期和细胞增殖相关的基因(图2B)。总之，排卵前卵泡中的9个GCs簇具有不同的功能，以促进排卵和LH/HCG信号后向黄体的转化。
图2 ScRNA图谱和排卵前卵泡中GC的不同功能簇
3.HCG促黄体生成过程中GCs的功能动态
为了进一步了解GC亚型的发育动力学，作者对GC的亚群进行了RNA速率分析。结果表明，G1是黄体生成素(luteinizing hormone，LH)激增后排卵前GCs的初始簇。G1指向G2，最终指向G4。G5指向G3和G6，这是GCs的另一个发育分支。潜伏时间显示，G5不是最初的集群，而是在发育中期出现的。LH/HCG激增后，参与P合成的G3和参与细胞粘附的G6被揭示为排卵前卵泡GCs的末端状态(图3A，B)。为了探索某些特殊基因对人类LH/HCG激素的响应，作者通过RNA速率分析探索了这些基因的响应时间。发现在LH/HCG后的初始时间，GCs中的激素合成从E2合成转变为P合成，这对于黄体生成很重要。并且发现与P合成相关的基因最早在LH/HCG之后被上调(图3C)。同时，参与E2合成的CYP19A1发生在LH/HCG之后的后期。此外，炎症相关基因、趋化因子和粘附分子随后被激活(图3C)。参与调节卵母细胞减数分裂成熟的基因(例如AREG和EREG)是LH/HCG后的最早反应基因(图3C)。这些发现表明，从E2合成到P合成的转变发生在炎症反应和细胞粘附功能之前，而最晚触发了卵母细胞减数分裂成熟的调节(图3D)。
图3 GC的RNA速度和轨迹分析
4.排卵前卵泡中存在具有多种功能的异质巨噬细胞群体
本研究鉴定出的免疫细胞包括巨噬细胞，DC，T细胞和中性粒细胞。巨噬细胞是排卵前卵泡中的主要免疫细胞类型。免疫荧光实验证实了在单个排卵前卵泡中同时检测到CD68巨噬细胞和STAR GCs(图5A)。单细胞分析确定了排卵前卵泡中的五个巨噬细胞簇(图5B)，它们在排卵过程中参与多种功能。其中，Mac1表现出抗炎的M2样表型。Mac2簇与炎症反应有关。与其他亚簇相比，Mac3中富集的基因和途径的差异表达下调(图5C，D)，表明该簇可能是未分化且不成熟的群体。Mac4在ECM的降解和重塑中起着重要作用(图5D，E)。Mac5的标记基因与粒细胞和细胞趋化性相关(图5C，D)，还表达与表皮生长因子相关的基因，包括AREG和EREG(图5C)，这是LH/HCG后卵母细胞减数分裂恢复中的重要基因。作者进一步通过免疫荧光染色的结果证实了排卵前卵泡中巨噬细胞中EREG蛋白的表达，这与在单细胞水平上检测到的表达一致(图5G)。已有研究报道EREG和AREG在GCs和卵泡膜细胞中表达。因此，该研究确定了一簇巨噬细胞Mac5，也可能是排卵前卵泡中EREG和AREG的来源。总的来说，排卵前卵泡中的巨噬细胞的不同群体在其表达谱和功能方面表现出明显的异质性。
图4 排卵前卵泡中存在免疫细胞
图5 在排卵前卵泡的巨噬细胞中鉴定出五个功能不同的簇
5.一种高黏附能力的G6细胞促进排卵前卵泡中免疫细胞浸润
作者发现这六个样本免疫细胞的比例明显不同，尤其是巨噬细胞(图6A)。根据免疫细胞的占比，将这6个样本划分成了免疫细胞占比低的组LI组(P1-P3样本)和免疫细胞占比高的组HI组(P4-P6样本)(图6A)。作者发现使用HCG/GnRH激动剂12h后，HI组患者的P水平明显高于LI组。且有研究表明卵巢中排卵和炎症反应的关键调节因子是P，它是由促黄体生成素信号诱导的，而促黄体生成素信号会启动免疫细胞在卵巢中的浸润。
GC是直接受P水平影响的主要细胞类型，为了进一步探索可能的机制，作者比较了两组GC群体的DEG。如图6B所示，HI组GCs中NFκBia的表达低于LI组，而PTGS2的表达高于LI组。据报道，NF-κB可与PTGS2启动子结合，增强PTGS2的转录活性，介导排卵过程中的炎症反应，受P调节。此外，与LI组相比，炎症反应相关基因在HI组GC中高表达(图6B)。相比之下，HI组GCs中PTX3和CTSL的表达明显低于LI组(图6C)。有研究表明PTX3的丢失阻止了小鼠放射冠细胞在排卵前卵泡中围绕卵母细胞排列，从而影响卵丘-卵母细胞复合体(cumulus–oocyte complexes，COC)的扩张、ECM的重塑和排卵。CTSL对ECM的重塑和排卵也很重要。进一步的分析表明，参与细胞粘附功能的GC的发育终态群体G6簇，主要出现在HI组患者中(图6D)。综上所述，排卵前卵泡的细胞亚型异质性，与巨噬细胞在卵泡中的粘附和滞留程度不同有关。这种滞留在排卵前卵泡中的巨噬细胞可能与GCs的终末状态G6有关 (图6D，E)以及与GCs中增强的炎症反应和不良的组织重塑有关。
图6 排卵前卵泡的内在异质性
6. 细胞通讯有助于排卵前卵泡的异质性
为了进一步了解GCs和免疫细胞之间的相互作用，作者进一步进行了细胞-细胞相互作用分析(图7A)。作者发现卵泡内颗粒细胞和巨噬细胞之间存在强烈的相互作用，涉及细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞粘附分子(CAM)、趋化因子信号通路和EGFR酪氨酸激酶通路(图7B)。所有这些相互作用都会促进巨噬细胞的趋化作用，使其粘附并停留在排卵前的卵泡中。此外，配体-受体相互作用的分析表明，Mac5通过EGFR与GC的亚型G2、G5和G6簇相互作用(图7C)。EGFR配体EREG是一个EGF样细胞因子家族成员，在GCs促进卵母细胞减数分裂恢复过程中发挥重要作用。
为了研究HI组和LI组在细胞通讯方面的差异，作者比较了这两组之间潜在的细胞-细胞相互作用。作者观察到，在HI组巨噬细胞簇与GC簇之间通过粘附分子发生更多潜在的相互作用(图6E)，这与HI组参与细胞粘附功能的GC簇(G6)的丰富程度一致(图6D)。因此，G6在GCs中的末端状态促进了巨噬细胞在排卵前卵泡中的粘附和滞留。反过来，巨噬细胞的浸润和富集在GC功能的调节以及DC、T细胞和中性粒细胞的招募中发挥了关键作用(图7F)。
图7 排卵前卵泡的细胞间相互作用
结论
该研究提供了第一个全面的人类排卵前卵泡微环境的单细胞转录图谱。这项工作为理解排卵前卵泡微环境中卵母细胞成熟和排卵的分子调控奠定了基础。巨噬细胞是促进卵母细胞成熟的另一种EREG来源，可能为卵母细胞体外成熟的发展开辟一条新的途径。ECM重塑和COC扩张相关基因的缺失可能导致排卵前卵泡不破裂，这将为黄素化未破裂卵泡综合征(LUFS)的病因诊断和治疗提供新的思路。
参考文献
Wu, H.; Zhu, R.; Zheng, B.; Liao, G.; Wang, F.; Ding, J.; Li, H.; Li, M. Single-Cell Sequencing Reveals an Intrinsic Heterogeneity of the Preovulatory Follicular Microenvironment. Biomolecules 2022, 12, 231. https://doi.org/10.3390/biom12020231.